于洋合作团队建立揭示生命早期发育奥秘的新模型——人造胚胎

2019年10月18日,美国索尔克(SALK)生物学研究所Belmonte课题组、德克萨斯大学西南医学中心吴军课题组及北京大学第三医院于洋课题组等在Cell杂志发表题为“Generation of blastocyst-like structures from mouse embryonic and adult cell cultures”的研究论文,报道利用扩展多能性干细胞在体外构建功能性的胚胎结构,而不经过传统受精方式。这个新模型未使用配子,可以以高通量方式揭示早期胚胎的发育机制,并构建机体各部分类器官,具有巨大潜力和应用价值。

胚胎发育是哺乳动物个体形成过程中的起始环节,但其数量的稀缺性决定这一过程中的奥秘很难利用传统技术来揭示。近年来,单细胞测序技术及胚胎体外重组技术的出现,使得人们逐渐揭开哺乳动物早期发育的神秘面纱。然而,单细胞测序技术发现的关键分子验证仍然需要大量的胚胎完成,而胚胎体外重组技术使用的两种类型细胞,决定了该技术仅能够重现囊胚期之后的胚胎结构,无法探索早期发育的生物学现象。因此,是否可以利用干细胞构建早期发育的胚胎从而更精准地模拟哺乳动物早期发育过程并探索其中的分子事件,值得深入研究,但目前尚无报道。

本研究利用扩展多能性干细胞(EPS)早期胚胎三种谱系均有贡献的能力,将分离的小鼠EPS细胞接种到微孔中(每个微孔5个细胞),形成小的聚集体。通过建立KSOM-ETS的条件培养基,同时联合应用FGF4、肝素、BMP4、CHIR99021和A83-01等小分子,及ROCK抑制剂Y-27632处理EPS细胞,可以获得与小鼠E3.5自然受精囊胚形态相似的类囊胚结构。研究人员进一步将耐嘌呤霉素和mCherry+EPS细胞与野生型EPS细胞以1:10的比例混合用于初始培养。24小时后,在分化培养基中加入低浓度的嘌呤霉素,以逐渐消除辅助细胞。利用这种策略,我们可以从单个EPS细胞中产生克隆性EPS囊胚,效率为2.7%。
E3.5小鼠囊胚有两种细胞系,即外滋养层(TE)和内细胞团(ICM)。我们检查了类囊胚是否也有这两种早期胚泡谱系。免疫荧光分析显示,类囊胚外层的细胞表达TE转录因子CDX2和EOMES,内层细胞中表达SOX2、NANOG和OCT4。在检测的140个类囊胚中,74.2%正确表达了TE-(CDX2+)和ICM(SOX2+)的谱系,15%只表达TE的谱系,1.4%只表达ICM样谱系,9.3%类囊胚中的TE和/或ICM的谱系定位错误。计算第4—6天类囊胚中TE和ICM的细胞数量,第4天和第5天的类囊胚在两个谱系中的细胞数量都少于E3.5自然受精囊胚,第6天两个谱系中的细胞数量与E3.5囊胚细胞数量相当。
随后,合作团队研究了早期植入前发育的关键细胞和分子事件是否可以在类囊胚形成过程中被重现。在种植后的4h内,发现细胞之间的连接松散。在种植后18小时左右,细胞开始形成紧密的聚集体,细胞粘附蛋白E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白ZO1开始在细胞-细胞连接处聚集。随后,研究团队发现在种植后的第3天,75%细胞聚集物呈现PAR6富集的极化特征。这些数据支持了类囊胚的形成,证实了早期植入前发育的致密化及极化特征的观点。
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为了深入了解类囊胚和自然受精囊胚在各个谱系中的异同,研究团队利用单细胞RNA测序技术,对从类囊胚和自然受精囊胚中收集的2700多个单细胞的转录体进行了分析。利用SEURAT进行的综合分析显示,来自类囊胚和自然受精囊胚的细胞基本上重叠在一起。聚类分析将所有细胞分为7个簇,其中4个簇由类囊胚和自然受精囊胚共享。为揭示EPS囊胚和囊胚在各个谱系中的差异,研究团队对差异表达基因进行了功能注释。两个样本之间的ICM或EPI谱系鉴定出53个差异表达基因,这些差异表达基因富含与干细胞维持、繁殖和DNA甲基化相关的功能项。两种多能性基因Sox2和Klf2在较低水平上表达(分别为28%和43%),Tet1和Dnmt3L,两种DNA甲基化相关酶基因,在类囊胚中表达水平降低了18%。对于PE谱系,在类囊胚和自然受精囊胚之间鉴定出67个差异表达基因,并且这些差异表达基因大多与囊泡运输和内吞有关。对于TE谱系,在两个样本之间仅发现两个差异表达基因(Gjb2和Arhgel6)存在显著差异。
利用体外体系对类囊胚结构进行长期培养,研究团队证明类囊胚经过体外培养可以产生一个圆筒结构,外胚层和EPI作为两个半球被内胚层包围。在培养的类囊胚中,观察到F-肌动蛋白在EPI样中心富集,细胞呈玫瑰花状结构,与小鼠E4.5–E4.75期的着床胚胎相似。极性蛋白aPKC排列在形成EPI样腔的细胞内,具有E5.25-E5.5胚胎的特征。

一个更严格的功能测试是验证它们是否能在子宫内发育成胎儿。为此,研究团队将类囊胚移植假孕小鼠的子宫中,在7.5 dpc时,自然受精囊胚移植小鼠和类囊胚移植的小鼠子宫内均形成蜕膜。染色证实了类囊胚来源的植入部位的血管通透性。移植实验从几个不同的系中产生的EPS囊胚进行,移植类囊胚中有7%植入并诱导蜕膜化。然而类囊胚产生的蜕膜的大小有所不同,有些与对照蜕膜相似,有些则小得多。利用特异标记的td-tomato基因的引物对其基因组进行PCR分析,明确蜕膜组织含有来源于类囊胚的td-tomato阳性细胞。免疫组化分析也证实了td-tomato阳性细胞的存在。此外,研究团队观察到,在6.5、7.5和8.5 dpc时,在类囊胚衍生蜕膜内形成了一些结构,与对照组相同时期胚胎相比,这些结构都显得发育迟缓或畸形。尽管如此,还是能够在从这些结构制备的切片中检测到OCT4+、EOMES+和GATA4+细胞的存在。这些结果提示类囊胚可以在子宫内植入、触发蜕膜化并继续生长。

该研究通过结合干细胞生物学、发育生物学和3D培养等多种手段,揭示了生命可以不从受精,而从单一细胞启动发育。研究人员相信,通过进一步优化体系并结合基因编辑技术,能够获得功能更加完整的类囊胚,发育到形成不同器官原基的阶段,从而成为类器官种子,用作器官移植的重要来源。

美国索尔克生物学研究所RonghuiLi,CuiqingZhong博士后及北京大学第三医院生殖医学中心/临床干细胞研究中心于洋副研究员为本文共同第一作者,美国索尔克生物学研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授和德克萨斯大学西南医学中心吴军助理教授为通讯作者。

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Juan Carlos Izpisua Belmonte,索尔克生物学研究所Roger Guillemin讲席教授。共发表学术论文470余篇,其中超过50篇发表在CNS期刊上,获专利19项,入选2013年Science杂志评选的世界十大年度突破,获得相关奖励37项,受邀参加350余次国际会议,进行大会keynote学术报告50余次。任26个国际SCI期刊的编委会成员,18个基金评审机构专家,80余家期刊的同行评议专家及多个国家及国际科学机构的科学咨询委员会成员。
吴军,助理教授。分别于山东大学及田纳西大学诺克斯维尔分校获得临床医学学士学位和生物学博士学位。经过南加州大学Martin Pera教授及索尔克生物学研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授实验室的博士后培训后,于2018年1月入职德克萨斯大学西南医学中心,担任分子生物学系助理教授。主要研究方向是利用多种技术手段开发新型干细胞,建立高效基因组和表观基因组编辑工具,专注于利用种间嵌合体来研究进化背景下的发育生物学、身体和器官大小的确定、物种的特定行为特征、抗癌性以及物种屏障的分子基础。在Nature、Cell等杂志发表SCI研究论文55篇。
于洋,副研究员。2009年于中国科学院动物研究所获得理学博士学位(导师为周琪研究员),2010年加入北京大学第三医院生殖医学中心乔杰教授研究团队,2018—2019年在美国索尔克生物学研究所以访问学者形式开展研究工作。主要研究方向为病理条件下女性生殖细胞的发育调控机理及研究模型的建立。在Cell、PNAS、Cell Research等杂志发表SCI研究论文80余篇。



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1. Li R, Zhong C, Yu Y, Liu H, Sakurai M, Yu L, Min Z, Shi L, Wei Y, Takahashi Y et al: Generation of Blastocyst-like Structures from Mouse Embryonic and Adult Cell Cultures. Cell 2019, 179(3):687-702 e618.

2. ?Yan L, Yang M, Guo H, Yang L, Wu J, Li R, Liu P, Lian Y, Zheng X, Yan J et al: Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 2013, 20(9):1131-1139.

3. Harrison SE, Sozen B, Christodoulou N, Kyprianou C, Zernicka-Goetz M: Assembly of embryonic and extraembryonic stem cells to mimic embryogenesis in vitro. Science 2017, 356(6334).


供稿单位:北京大学第三医院